Публикация:Матвеева НА (2009) Создание генетически модифицированных растений семейств Compositae и...

Материал из ИКБГИ
Перейти к: навигация, поиск

Матвеева Н.А. (2009) Создание генетически модифицированных растений семейств Compositae и Solanaceae. // Автореф. дис. ... канд. биол. наук. - Киев, 2009. - 22 с.

Анотация

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 – биотехнология. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2009.

В диссертационной работе методами клеточной и генетической инженерии созданы трансгенные и транспластомные растения семейств Compositae и Solanaceae (Solanum rickii, Solanum tuberosum, Lycopersicon peruvianum, Lactuca sativa, Cichorium intybus), которые имеют как маркерные гены, так и гены, кодирующие белки фармацевтического назначения.

Методом биолистической трансформации созданы транспластомные растения дикого вида S. rickii с геном aadA. Использование для селекции трансформированных растений одновременно двух антибиотиков, спектиномицина и стрептомицина, дало возможность эффективно осуществлять отбор трансформантов и избегать появления спонтанных мутантов, что подтверждено ПЦР-анализом тотальной ДНК регенерантов.

Показана возможность перенесения методом соматической гибридизации трансформированных пластид S. rickii в цибридные растения L. peruvianum + (S. rickii) и гибриды S. tuberosum + S. rickii. После γ-слияния мезофильных протопластов хлорофиллдефектного мутанта L. peruvianum и транспластомного растения S. rickii на селективной среде с антибиотиками спектиномицином и стрептомицином получены цибриды, имевшие трансформированные хлоропласты S. rickii и ядерный геном L. рeruvianum. Такой результат подтвержден анализом хлоропластной и ядерной ДНК цибридов. Путем переноса хлоропластов S. rickii и получения в условиях селекции зеленых цибридных растений была подтверджена хлоропластная природа осуществленной нами трансформации растений S. rickii. Одновременное использование хлорофиллдефектного мутанта L. peruvianum и селективного маркерного гена в хлоропластах S. rickii позволило отобрать растения, имевшие трансформированные хлоропласты S. rickii. В то же время, облучение донора хлоропластов способствовало селекции растений, имевших ядерную ДНК реципиента.

Проведены эксперименты по слиянию мезофильных протопластов S. tuberosum сортов Луговской и Славянка з геном nptII в ядерной ДНК и транспластомного S. rickii с геном aadА в хлоропластах. На селективной среде с тремя антибиотиками - канамицином, спектиномицином и стрептомицином - получены гибридные растения. Они имели гены aadА и nptII, хлоропластную ДНК S. rickii и S. tuberosum, гибридный ядерный геном. Использование селективного давления при наличии у одного из родителей маркерного гена в хлоропластах, а у другого – в ядерной ДНК, позволяет без инактивации ядерной ДНК донора с высокой вероятностью получить гибридные растения, содержащие оба маркерных гена.

Путем агробактериальной трансформации конструкциями рСВ063 и рСВ064 с селективным геном nptII и целевыми генами белков-антигенов ESAT6 и ESAT6:Ag85В(-ТМД) получены трансгенные растения трех сортов салата. Частота трансформации эксплантов составила 18 – 62%. Анализ геномной ДНК выявил наличие в регенерированных растениях как селективного, так и целевых генов. В то же время, анализ обратных транскриптов показал, что при стабильной транскрипции селективного гена возможно как наличие, так и отсутствие мРНК целевого гена. В четырех из шести анализировавшихся растений детектировалась транскрипция как селективного, так и целевого генов. Анализ наследования селективного гена nptII показал отсутствие расщепления по этому признаку в растениях Т1 та Т2 поколений. Все анализировавшиеся растения Т1 та Т2 имели как селективный, так и целевой гены.

Оптимизированы условия регенерации растений из семядольных эксплантов цикория Cichorium intybus. Частота регенерации на питательной среде MS с 0,5 – 2,5 мг/л кинетина составляла 100%. Методом агробактериальной трансформации конструкцией рСВ124 с селективным nptII и целевым ifn–α2b генами получены трансгенные растения, причем частота трансформации эксплантов составляла 26,9%. По результатам анализа регенерованные растения имели как селективный, так и целевой гены.


Ключевые слова

Lactuca sativa, Cichorium inhybus, Solanum rickii, Solanum tuberosum, Lycopersicon рeruvianum, биолистическая трансформация, агробактериальная трансформация, соматическая гибридизация.

Полный текст

Полный текст в формате pdf (укр)

Персональные инструменты
На других языках