Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини / Щербак Н.Л. та ін. 2015
Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини
Щербак Н.Л., Василенко М.Ю., Кучук М.В.
Колаген I типу є важливим сировинним матеріалом для цілого ряду напрямків фармацевтичного виробництва і використовується як хірургічний шовный матеріал, як допоміжна речовина в технології мазей, супозиторіїв, розчинів для ін’єкцій, очних лікарських плівок та ін. Технологія отримання рекомбінантного колагену дозволила отримувати більш однорідний та безпечний колаген.
Метою нашої роботи було створення трансгенних рослин N. benthamiana – адаптованих продуцентів для транзієнтної експресії колагену людини, в яких відбувається пост-трансляційна модифікація цього рекомбінантного білка. завдяки перенесенню в геном цих рослин послідовностей, що кодують фермент проліл-4-гідроксилазу та експресії цього ферменту, стає можливим гідроксилювання залишків проліну в молекулі колагену, що в свою чергу забезпечує утворення коректної просторової структури полімерного колагену.
Рослини N. benthamiana є модельним об’єктом для синтезу рекомбінантних білків, тому для проведення досліджень, щодо експресії генів колагену людини І-го типу, був вибраний саме цей вид. Гідроксилювання залишків проліну в молекулі колагену є необхідною складовою процесу дозрівання молекули колагену в людському організмі, отже наявність ферменту проліл-4-гідроксилази людини в клітинах N. benthamiana є вкрай важливим фактором для коректного формування молекули колагену. Створення трансгенних рослин N. benthamiana, які мають у своїх клітинах проліл-4-гідроксилазну активність, дає можливість отримати адаптовані продуценти для синтезу колагену в рослинній системі.
Для створення рослин N. benthamiana із гідроксилазною активністю за людським типом було проведено клонування генів α- та β-субодиниці ферменту (P4H- α та P4H- β) за допомогою ПЛР та створення генетичних конструкцій для трансформації рослин. Для проведення генетичної трансформації ми використовували суміш суспензій двох агробактеріальних культур, кожна з якої містила відповідний вектор.
В обох векторах, рСВ210 та рСВ226, для селекції рослин був використаний ген bar, що надає трансгенним рослинам стійкість до гербіциду фосфінотрицину. В умовах такої селекції, приблизно 30 % трансгенних рослин мали в своєму геномі послідовності обох субодиниць проліл-4-гідроксилази. На рисунку 2-г видно відсутність відповідного сигналу після проведення ПЛР (доріжки 4, 5), що свідчить про відсутність гена P4H-β в геномі цих рослин, тоді як наявність гена P4H-α в них підтверджується (рис. 2-б). Вкорінені рослини, в геномі яких за допомогою ПЛР було підтверджено наявність обох субодиниць проліл-4-гідроксилази, переносили в ґрунт в умовах теплиці. Перенесені в ґрунт
Висновки
Були створені генетичні конструкції для агробактеріальної трансформаціі, які містять генетичні послідовності α- та β-субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази, проведено генетичну трансформацію рослин N.benthamiana. В результаті були отримані трансгенні рослини N. benthamiana, що містять гени α- та β-субодиниць ферменту проліл-4-гідроксилази, наявність яких в геномі підтверджена за допомогою ПЛР. Ми вважаємо, що такі рослини можуть бути використані, як адаптовані продуценти, в яких забезпечується пост-трансляційна модифікація ланцюгів колагену, а саме гідроксилювання залишків проліну, що синтезуються транзієнтно.
Джерела
- Щербак Н.Л., Василенко М.Ю., Кучук М.В. Отримання трансгенних рослин Nicotiana benthamiana, в яких проходить експресія генів проліл-4-гідроксилази людини // Фактори експериментальної еволюції органiзмiв: Зб. наук. пр. / Національна академія наук України, Інститут молекулярної біології і генетикп, Укр. Т-во генетиків і селекціонерів iм. М.I. Вавилова; редкол. / В. А. Кунах (голов. ред.) [та iн.] – К.: Укр. т-во генетиків і селекціонерів ім. М.І. Вавилова, 2015. – Т. 17. – С. 265-269
- Доклад на X Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов»