Публікація:Кучук Н.В. (1997) Генетическая инженерия высших растений

Матеріал з ІКБГІ
Перейти до: навігація, пошук

Кучук Н.В. Генетическая инженерия высших растений // НАН Украины. Ин-т клеточной биологии и генетической инженерии. - Киев: - Наук. думка, 1997. - 152 с. - ISBN 966-00-0129-0
УДК 575.22:577.21

Н.В. Кучук Генетическая инженерия высших растений

В монографии рассмотрены вопросы, связанные с получением трансгенных и трансгеномных растений, основные принципы конструирования векторов и проблемы экспрессии переносимых генов в геномах растений. Большое внимание уделено вопросам получения трансгенных растений у сельскохозяйственных видов растений и основным достижениям генетической инженерии в области практического применения.
Для специалистов в области генетики, клеточной биологии, физиологии растений, селекции, а также студентов вузов.

Введение

Развитие генетической науки привело к появлению новой сферы человеческой деятельности, связанной с изменением генетической конституции живых существ с помощью новых подходов и технологий, которые объединяются под общим названием генетическая, или генная, инженерия. Уже сейчас в микробиологической и фармацевтической промышленности, сельском хозяйстве используются штаммы бактерий, грибов, дрожжей, клеточные линии растений и животных, сорта растений, которые получены с использованием генноинженерных приемов. Для измененных таким образом многоклеточных существ возникло даже особое название — «трансгенные организмы». Трансгенные организмы — это растения, рыбы, животные, другие живые существа, несущие в своем геноме генетическую информацию, введенную с помощью методов генетической трансформации. Появление трансгенных организмов связано как с развитием методов собственно генной инженерии, т. е. технологии рекомбинантных ДНК, так и с разработкой методов введения реконструированной ДНК в живые клетки и регенерации из них физиологически нормальных многоклеточных существ.

Хотя с момента опубликования первых сообщений о получении генноинженерно-измененных эукариотических организмов прошло не более 15 лет, в настоящее время уже существует ряд коммерческих фирм, основной целью которых является создание трансгенных существ с новыми полезными признаками. Мы попытались сосредоточиться на вопросах получения и использования трансгенных и трансгеномных растений. Трансгенные растения — термин, принятый для обозначения растений, полученных с использованием методов генетической инженерии, которые позволяют изолировать ген из любого живого организма и встроить его в геном того или иного вида растения. Трансгеномные растения — это растения, полученные с помощью методов соматической гибридизации, которые дополнительно к своему собственному геному несут блоки генов от особей этого же вида или других растительных видов.

Само понятие «трансгенные растения» появилось на рубеже 70–80-х годов, когда работами лабораторий Дж. Шелла (ФРГ), М. Ван Монтагю (Бельгия), Р. Шилпероорта (Голландия) и Е. Нестера (США) было доказано, что почвенная бактерия Agrobacterium tumefaciens, вызывающая болезнь корончатые галлы, способна переносить и встраивать часть своей большой Ti‑плазмиды, так называемую Т‑ДНК, в ядерный геном растений. По сути, именно эти работы легли в основу генетической инженерии растений. На основе A. tumefaciens были созданы первые векторы для генетической трансформации и получены первые трансгенные растения. И хотя к настоящему времени разработаны многие системы генетической трансформации растений, не использующие А. tumefaciens в качестве вектора, именно данное научное достижение открыло новые возможности для биологии растений. Впервые исследователи, работающие в этой области, смогли перейти от теоретических построений, которые описывали функционирование растительной клетки на основе фактов, полученных за счет в той или иной степени разрушающих целостную структуру методов, к практической проверке своих гипотез в живой системе.

Генетическая инженерия растений разделена на взаимопроникающие области. Одна из них объединяет все методы молекулярной биологии, связанные с получением рекомбинантных молекул ДНК. Эти технологии разрабатывают подходы для изолирования, клонирования, модификации генов, предназначенных для введения в растительную клетку. Другая охватывает методы генетической трансформации растений, отбора трансформированных растительных клонов и линий, регенерации трансгенных растений, размножения, получение потомства, а также изучает проблемы встраивания и экспрессии перенесенных генов.

Генетическая инженерия растений возникла в результате развития молекулярной генетики и физиологии растений. Основным постулатом молекулярной генетики является представление, что кодирование генетических признаков осуществляется последовательностью нуклеотидных оснований ДНК. В результате изучения этих нуклеотидных последовательностей, а также их взаимодействия с ферментативным аппаратом клетки были выяснены механизмы экспрессии генов, возможные пути их регуляции. В то же время проверка этих гипотез в живой эукариотической системе, в частности для растений, длительное время была затруднена. Особенно это касалось генов, проявляющихся не на клеточном, а на уровне целого организма.

Один из аспектов физиологии растений — изучение функционирования отдельных клеток, разработка методических приемов их культивирования. Одним из важнейших научных положений, установленных этой наукой, является принцип тотипотентности — возможность получения полноценного фертильного организма из любой клетки растения. Физиология растений и генетика послужили также основой для создания и развития клеточной инженерии как составной части генетической инженерии растений. В начале 70‑х годов работы Г. Мельхерса (ФРГ) и Ю. Ю. Глебы (Украина) впервые открыли возможность конструирования растений путем слияния протопластов — клеток без клеточной стенки. Эксперименты этих ученых сделали возможным комбинирование целых геномов или блоков генов в одном растении, даже если половое скрещивание между родителями невозможно.

Кроме решения чисто фундаментальных вопросов генетическая инженерия растений открывает новые перспективы и для практического применения современных достижений биологии. Практическая селекция культурных растений испытывает острую нужду в методах, позволяющих свободно манипулировать отдельными генетическими признаками. Причем во многих случаях эти признаки вообще были вне досягаемости для обычных методов, применяемых в селекции, так как кодировались генами, принадлежащими видам в таксономическом отношении далеко удаленным от культурных растений. Классическая селекция в лучшем случае могла использовать гены только ближайших родственников культурных растений, но и эта возможность сопровождалась дополнительным балластом нежелательных генов, от которого нужно было избавляться длительным возвратным скрещиванием с большим риском утратить немногие полезные признаки. Весь же оставшийся генофонд живой природы был полностью недоступен для применения в селекционной практике.

Генетическая и клеточная инженерия растений активно развивается в институтах Национальной академии наук Украины, в первую очередь в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии первоначально Института ботаники им. Н. Г. Холодного HAH Украины, а впоследствии в Институте клеточной биологии и генетической инженерии (ИКБГИ) HAH Украины, возглавляемом академиком HAH Украины Ю. Ю. Глебой. Именно в этом отделе в сотрудничестве с институтами Российской академии наук, такими, как Институт молекулярной биологии (Москва), Институт молекулярной генетики (Москва), Институт физиологии и биохимии микроорганизмов (Пущино) были получены первые трансгенные растения на территории бывшего СССР. В области клеточной инженерии ИКБГИ HAH Украины является одним из ведущих мировых центров. Работы по генетической инженерии растений активно ведутся также в научно‑исследовательских учреждениях Украинской аграрной академии наук.

Мы попытались рассмотреть вопросы, связанные с получением трансгенных растений, генетические конструкции и векторы, наиболее часто используемые в генетической трансформации растений. Также постарались осветить проблемы получения трансгенных растений у видов, представляющих практический интерес, показать те новые возможности, которые появились в результате использования генетической инженерии растений. Представлены результаты экспериментов по генетической инженерии у сельскохозяйственных видов, принадлежащих к семейству бобовых, которые проводились в отделе цитофизиологии и клеточной инженерии ИКБГИ HAH Украины. Рассмотрены некоторые аспекты клеточной инженерии растений, в частности, проблемы асимметричной соматической гибридизации, и представлены результаты таких экспериментов у видов семейства бобовых.

Одна из важных проблем, с которой столкнулась генная инженерия растений, — это настороженное восприятие общественным мнением, в первую очередь в некоторых развитых странах Европы, самого факта появления на полях мира трансгенных растений и употребления их в пищу. С научной точки зрения это скорее психологический, чем научный вопрос, и связан он, прежде всего, с теми реальными проблемами, которые возникли в результате интенсивного сельскохозяйственного производства, применяющего в больших количествах химические средства защиты растений, удобрения, гормоны роста и т. д. Не касаясь всех аспектов, необходимо лишь отметить, что по данным ФАО (Международной продовольственной организации) мировые запасы продовольствия, несмотря на все успехи интенсивного производства, за последние годы стали уменьшаться. Кроме того, к сожалению, на сегодняшний день продукция так называемого органического земледелия, т. е. не применяющего различного рода химические вещества, гормоны, витамины и т. п., не способна обеспечить по приемлемым ценам потребности в пище даже большинство населения стран развитого Запада. Все это заставляет искать новые методы ведения интенсивного сельскохозяйственного производства, включая более современные и с научной точки зрения более безопасные подходы с использованием трансгенных растений. Одновременно необходимо отказываться от устаревших и опасных для окружающей природы и здоровья человека аграрных технологий.

В действительности, именно применение трансгенных растений, способных противостоять различного рода насекомым, патогенам, неблагоприятным факторам окружающей среды без дополнительных обработок химическими веществами или же с применением гораздо меньшего их количества, может значительно улучшить экологическое состояние природы и сделать более «органическими» продукты питания для человечества. Генетическая инженерия растений оперирует с теми же веществами — молекулами нуклеиновых кислот и белков, с которыми человечество сталкивается постоянно за своим обеденным столом. В отличие от химического производства она не создает новые вещества, которые были бы незнакомы человеческому организму или природе в целом. Эта технология свободна от загрязняющих мир токсических отходов. Более того, освобождая сельское хозяйство от применения химикатов, она не только производит более экологически ценный продукт, но и снижает уровень отходов, возникающих в связи с работой химических заводов, производящих эти вещества.

Конечно, существует ряд вопросов, связанных с проблемой выхода трансгенных растений из условий in vitro в окружающую среду. К ним относится возможность передачи трансгенных признаков от культурных растений их диким сородичам и вследствие этого их неконтролируемое распространение в живой природе. Особенное волнение в связи с этим вызывают признаки устойчивости к гербицидам. Новую остроту эта проблема приобрела в связи с появлением маленькой заметки датских исследователей в журнале «Nature» (Mikkelsen et al., 1996). Их исследование возможности переноса признака устойчивости к гербициду BASTA (фосфинотрицину) от культурного трансгенного растения рапса Brassica napus (хромосомное число 2n=38) к его дикому сородичу сурепке В. campestris (хромосомное число 2n=20) показало, что после спонтанного опыления пыльцой трансгенного рапса нетрансгенной сурепки возникают растения морфологически В. campestris (2n=20), устойчивые к BASTA. К сожалению, в этой заметке не было приведено никаких молекулярно-биологических доказательств, свидетельствующих, что действительно полученные устойчивые к BASTA растения В. campestris являются трансгенными, кроме того, из текста заметки не совсем понятно, как оценивался уровень устойчивости к BASTA у полученных семян. В то же время, несмотря на указанные замечания, нельзя исключать возможности переноса генов от трансгенных культурных растений к их диким сородичам. Эта проблема действительно требует своего решения, необходимо лишь отметить, что сами гербициды во многих случаях индуцируют мутационные изменения и отбор растений‑сорняков, устойчивых к этим химическим соединениям. Так что применение как трансгенных растений, устойчивых к гербицидам, так и самих гербицидов требует общих компромиссных решений, связанных с охраной окружающей среды.

Опасения вызывает и неконтролируемое распространение генов устойчивости к антибиотикам, которые очень часто используются как на стадии получения рекомбинантных молекул ДНК, так и в качестве селективных маркеров для отбора трансгенных растений. Эти опасения имеют право на существование, однако пока нет научных исследований, которые достаточно четко оценили бы действительную угрозу такого явления.

Переходя к изложению основной части предлагаемой вашему вниманию работы, нам еще раз хотелось бы подчеркнуть, что возникшее на рубеже 70‑80‑х годов новое направление в биологии растений под общим названием «генетическая инженерия растений» впервые предоставило исследователям возможность не только изучать механизмы жизнедеятельности организмов, но и сознательно вмешиваться в них. Трудно до конца оценить все перспективы происходящих в настоящее время процессов в общей и прикладной биологии растений. Одно можно утверждать точно: современное развитие как биологической науки, так и сельскохозяйственного производства немыслимо без знания и использования генетической инженерии.

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ ... 3

Глава 1. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ ... 10
1.1. Механизм трансформации растительных клеток бактериями рода Agrobacterium ... 10
1.2. Гены Т-ДНК ... 14
1.3. Конструирование «обезоруженных» векторов ... 17
1.4. Трансгенные растения с измененным гормональным балансом ауксинов и цитокининов ... 19
1.5. Промоторы, селективные и репортерные гены, используемые в генетической инженерии растений ... 21
1.6. «Молчание» перенесенных генов в трансгенных растениях ... 28
1.7. Наследование приобретенных признаков после генетической трансформации, опосредованной А. tumefaciens ... 29
1.8. Методы генетической трансформации высших растений с использованием A. tumefaciens ... 30
1.9. Получение трансгенных растений у хозяйственно ценных видов путем генетической трансформации, опосредованной А. tumefaciens ... 32
1.10. Генетическая трансформация высших растений с использованием неагробактериальных систем переноса генов ... 35
1.11. Генетическая трансформация хлоропластной ДНК ... 42

Глава 2. ТРАНСГЕННЫЕ РАСТЕНИЯ ДЛЯ ЦЕЛЕЙ ПРАКТИЧЕСКОЙ СЕЛЕКЦИИ ... 45
2.1. Повышение общей продуктивности растений ... 45
2.2. Устойчивость к гербицидам ... 47
2.3. Устойчивость к насекомым ... 48
2.4. Устойчивость к вирусам ... 50
2.5. Регуляция сроков созревания ... 52
2.6. Устойчивость к грибным, бактериальным заболеваниям и нематодам ... 53
2.7. Устойчивость к абиотическим стрессам ... 55
2.8. Мужскостерильные формы растений ... 57
2.9. Сбалансированный аминокислотный состав запасных белков ... 58
2.10. Измененный состав растительного масла ... 59
2.11. Получение белков, антител, вакцин в трансгенных растениях ... 60
2.12. Изменение состава накапливаемых углеводов, вторичных метаболитов, вкусовых и товарных свойств у трансгенных растений ... 62
2.13. Изменение окраски цветков у декоративных растений ... 63

Глава 3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ТРАНСФОРМАЦИЯ РАСТЕНИЙ — ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ СЕМЕЙСТВА БОБОВЫХ ... 65
3.1. Культивирование протопластов, изолированных из растений — представителей семейства бобовых ... 66
3.2. Получение трансгенных растений люцерны и гороха с улучшенными регенерационными способностями ... 74
3.3. «Прямой» перенос генов путем электропорации протопластов у видов семейства бобовых ... 81
3.4. Конструирование растений гороха, содержащих мобильный Ds-элемент кукурузы ... 87
3.5. Получение трансгенных растений гороха, устойчивых к фосфинотрицину ... 94
3.6. Получение трансгенных линий корней у гороха и люцерны хмелевидной с использованием Ri‑плазмиды из А. rhizogenes ... 96

Глава 4. АСИММЕТРИЧНАЯ СОМАТИЧЕСКАЯ ГИБРИДИЗАЦИЯ КАК ОДИН ИЗ СПОСОБОВ ПЕРЕНОСА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ МЕЖДУ РАСТЕНИЯМИ ... 99
4.1. Получение соматических гибридов с использованием гамма‑облучения ... 99
4.2. Соматическая гибридизация между видами семейства бобовых ... 108

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ... 118

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ... 121

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ... 122



Особисті інструменти
Простори назв

Варіанти
Дії
 
   
Інструменти