Генетична трансформація салату Lactuca sativa

Матеріал з ІКБГІ
Версія від 09:04, 1 жовтня 2015; WikiSysop (обговореннявнесок)

(різн.) ← Попередня версія • Поточна версія (різн.) • Новіша версія → (різн.)
Перейти до: навігація, пошук

Оскільки відомою є сортозалежність частоти регенерації рослин, нами було здійснено скрінінг 8 сортів салату. Показано, що на середовищі S1 з макро- та мікроелементами MS, 3 мг/л кінетину та 0,5 мг/л НОК спостерігалася висока частота регенерації пагонів для більшості сортів: для сорту Єралаш 95%, Гренада - 96%, Рубінове мереживо - 98%, Сніжинка - 80%, Ред корал - 82 %, Грін корал - 80%, Єва -20%, Майська королева - 5% (Матвеева и др., 2009). Було виявлено, що найвищий регенераційний потенціал мали проксимальні частини сім’ядольних листків салату незалежно від сорту. При їх культивуванні на середовищі S1 пряма регенерація рослин починалася через 7-8 діб. Утворювалося 10-15 пагонів на експлант розміром 3х5мм, в той час як на дистальній та середній частинах листків в цей термін пагони не утворювалися.

Для трансформації салату-латуку L. sativa сортів Єралаш, Рубінове мереживо та Сніжинка було використано конструкції рСВ063 та рСВ064 з генами esxA та esxA- fbpBΔTMD, що кодують туберкульозні антигени ESAT6 і ESAT6:Ag85В(-TMD). Після кокультивування з бактерією експланти переносили на середовище S-1 з 25 мг/л Km для селекції трансформованих клонів та 500 мг/л Cef для елімінації бактерій. Завдяки високій регенераційній здатності сорту Єралаш частота трансформації експлантів (відношення кількості експлантів із зеленими на селективному середовищі пагонами до загальної кількості експлантів) склала 62% при використанні конструкції pCB063 і 44% для конструкції pCB064. Для сортів Рубінове мереживо та Сніжинка (pCB064) ці показники становили відповідно 32 % і 18 %. Таким чином, частота трансформації експлантів різних сортів дещо відрізнялася. На нашу думку, це пов’язано з сортовою відмінністю в регенерації рослин. В результаті селекції було отримано більше 100 зелених рослин трьох сортів (рис. 9, а). Аналіз 11 рослин сорту Єралаш (pCB063 та pCB064), 6 рослин сорту Рубінове мереживо (pCB064), 4 рослин сорту Сніжинка (pCB064) виявив присутність як nptII, так і цільових генів esxA та esxA- fbpBΔTMD у всіх рослин крім одної (рис. 9, б).

Селекція рослин салату на наявність гена nptII (рис 9а Матвєєва автореферат).jpg ПЛР-аналіз наявності гена синтезу білку ESAT6 (1-5) та nptII (6-10) в трансгенних рослинах салату (рис 9а Матвєєва автореферат).jpg

Рис. 9. Селекція (а) та ПЛР-аналіз (б) наявності гена синтезу білку ESAT6 (1-5) та nptII (6-10) в трансгенних рослинах салату: 1, 6 – негативний контроль; 2, 7 – плазмідна ДНК; 3, 8 – нетрансформовані; 4-5, 9-10 – трансформовані рослини


Для з’ясування питання щодо експресії гена nptII на рівні транскрипції в рослинах сортів Сніжинка (3 зразки), Єралаш (2 зразки) та Рубінове мереживо (2 зразки) проводили полімеразну ланцюгову реакцію, поєднану зі зворотною транскрипцією (ЗТ-ПЛР) (рис.10).

Аналіз наявності мРНК виявив, що транскрипція гена nptII здійснювалася у всіх аналізованих рослинах незалежно від сорту та використовуваної для трансформації конструкції (рис.10, лінії 3, 9). У той же час ген esxA транскрибувався не у всіх випадках. Виявлено мовчання генів - хоча в геномній ДНК ген білка-антигена ESAT6 був присутній (рис.10, лінії 7, 13), його зворотні транскрипти не завжди детектувались (рис.10, лінії 5, 11). Аналіз успадкування селективного гена nptII виявив відсутність розщеплення за цією ознакою в рослинах Т1 та Т2 поколінь. Рослини Т1 та Т2 мали як селективний, так і цільовий гени.


Аналіз зворотних транскриптів (РНК-ЗТ, 2-5, 8-11) і геномної ДНК (ДНК, 6-7, 12-13) трансформованих рослин салату (рис 10 Матвєєва автореферат).jpg

Рис. 10. Аналіз зворотних транскриптів (РНК-ЗТ, 2-5, 8-11) і геномної ДНК (ДНК, 6-7, 12-13) трансформованих рослин салату: М – маркер; 1 – ДНК нетрансформованої рослини; 2-13 – трансформовані рослини: 6, 12 - ген nptII; 7, 13 - ген esxA; 3, 9 – зворотні транскрипти гена nptII; 5, 11 - зворотні транскрипти гена esxA; 2, 4, 8, 10 – відсутність синтезу зворотних транскриптів у відсутності ревертази

Таким чином, методом агробактеріальної трансформації з високою частотою створено генетично модифіковані рослини салату трьох сортів з генами бактеріальних антигенів ESAT6 та ESAT6:Ag85В(-ТМД). Показано, що в цих рослинах можлива як наявність, так і відсутність транскрипції цільового гена за стабільної транскрипції селективного гена. Трансгени успадковувалися та детектувалися у рослин наступних поколінь (Т1 та Т2). Салат як об’єкт з високим регенераційним потенціалом може бути використаний для створення генетично модифікованих рослин (їстівних вакцин).

Публікації по темі

Особисті інструменти
Простори назв

Варіанти
Дії
 
   
Інструменти