Генетична трансформація цикорію Cіchorium intybus

Цикорій є відносно новим об'єктом генетичної інженерії. Інтерес до цієї рослини викликаний її природними лікарськими властивостями. Цикорій є антигепатотоксичним, противиразковим, протизапальним, кардіотонічним, діуретичним засобом та застосовується при лікуванні діабету, СНІДу, пухлин, тахікардії та інших хвороб. На основі цикорію створено ряд лікарських препаратів. Крім того, як показали наші дослідження, листові експланти цикорію мають високу здатність до регенерації (Матвєєва та ін., 2009). Отже, становить інтерес використання цієї рослини як об'єкта трансформації, зокрема, для створення їстівних вакцин.

Регенераційну здатність цикорію вивчали, культивуючи листові експланти на середовищах з різним вмістом макроелементів та фітогормонів, як описано в роботі (Матвєєва та ін., 2009). При культивуванні експлантів утворення пагонів спостерігалося уже через 10-15 діб. Показано, що оптимальною умовою є наявність макроелементів середовища MS.

Вплив мінерального складу середовища з 0,5 мг/л кінетину та 0,5 мг/л α-нафтилоцтової кислоти на регенерацію рослин цикорію: зліва - MS, зправа - В₅

Частота регенерації пагонів на цих середовищах коливалася в межах 60 -100%, в той час як при наявності макроелементів за В₅ цей показник дорівнював 0 - 50%. При порівнянні впливу фітогормонів на процес регенерації пагонів встановлено, що використання кінетину дає можливість отримати значно більшу кількість регенерованих рослин. Зокрема, частота регенерації на середовищі № 2 (MS, 0,5 мг/л кінетину) перевищувала таку для середовища № 4 (MS, 0,5 мг/л БАП) та становила 100 та 70 % відповідно. Збільшення концентрації цитокінінів (як кінетину, так і БАП) з 0,5 до 2,5 мг/л не призводило до суттєвого збільшення частоти регенерації.

Для трансформації використовували A. tumefaciens (штам GV3101) з вектором pCB124 (селективний ген nptII, цільовий ген інтерферону–α2b). Трансформацію цикорію проводили за методикою, описаною в роботі (Матвєєва та ін., 2009). Відбір трансформованих клонів здійснювали при концентрації канаміцину 25 мг/л. На середовищі MS з 2,5 мг/л кін, 0,5 мг/л НОК, 25 мг/л Km та 600 мг/л Cef уже через 7-14 діб спостерігали початок утворення пагонів.

Частота трансформації експлантів становила 26,9%. Очевидно, досить високий показник пов'язаний з високою регенераційною здатністю рослин цього сорту (до 100 %). В ході селекції експлантів на середовищі з Km білі рослини були відсутні.

Аналіз тотальної ДНК восьми регенерованих рослин показав присутність у всіх як селективного гена nptII, так і цільового гена ifn– α2b (рис. 12).

ПЛР-аналіз тотальної ДНК (зліва) рослин цикорію (зправа) на присутність генів nptII (1, 2) та ifn– α2b (5, 6); 3, 7– негативний контроль; 4, 8 – плазмідна ДНК

Таким чином, було визначено частоту регенерації цикорію сорту “Пала росса”, яка становила до 100%. Показано, що найкращим середовищем для регенерації рослин з сім'ядольних та справжніх листків є таке, що містить макроелементи MS з 0,5–2,5 мг/л кінетину. Після агробактеріальної трансформації конструкцією рСВ124 отримано генетично модифіковані рослини з частотою трансформації експлантів 26,9%. За результатами аналізу тотальної ДНК регенеровані рослини містили як селективний nptII, так і цільовий ifn–α2b гени. Застосована методика трансформації може бути використана для отримання трансгенних рослин цикорію.

Публікації по темі

• Публікація:Матвєєва НА та ін (2009) Перенесення гена біосинтезу інтерферону-α2b в рослини цикорію (Cichorium intybus L) методом агробактеріальної трансформації
• Публікація:Матвєєва НА (2009) Створення генетично модифікованих рослин родин Compositae та Solanaceae