Публікація:Дубровна О.В. та ін. (2014) Біотехнології пшениці: клітинна селекція та генетична інженерія

Матеріал з ІКБГІ
(відмінності між версіями)
Перейти до: навігація, пошук
Рядок 1: Рядок 1:
[[Моргун Богдан Володимирович|Моргун Б.В.]], Тищенко Е.Н. Молекулярные биотехнологии по повышению устойчивости культурных злаков к осмотическим стрессам : [монографія] – К.: Логос, 2014. – 221 с. – Бібліогр.: с. 188–220. ISBN 978-966-171-887-5;<br>
+
Дубровна О.В., [[Моргун Богдан Володимирович|Моргун Б.В.]], Бавол А.В. Біотехнології пшениці: клітинна селекція та генетична інженерія. К.: Логос, 2014. – 375 с. ISBN 978-966-171-883-7.
УДК 577:606:633.11; ББК 28.070+28.54; М79
+
 
 +
УДК 602.6:582.542.11; ББК 28.04+28.592.71; Д79
  
 
[[Image:25v1 book expo 2021.jpg|Дубровна&nbsp;О.В., Моргун&nbsp;Б.В., Бавол&nbsp;А.В. Біотехнології пшениці: клітинна селекція та генетична інженерія|320x320px|right|border]]
 
[[Image:25v1 book expo 2021.jpg|Дубровна&nbsp;О.В., Моргун&nbsp;Б.В., Бавол&nbsp;А.В. Біотехнології пшениці: клітинна селекція та генетична інженерія|320x320px|right|border]]
  
В монографии рассмотрено современное состояние молекулярных биотехнологий, направленных на повышение уровня устойчивости культурных злаков к осмотическим стрессам. Проанализирована перспективность использования генов транскрипционных факторов и структурных генов, связанных со стресс-устойчивостью. Значительное внимание уделено теоретическим и практическим вопросам генетической трансформации растений ''in vitro'' и ''in planta''. Обсуждены эпигенетические вопросы трансгенеза, в том числе касающиеся разработки siPHK-технологий. Представлены результаты физиолого-биохимических аспектов молекулярных биотехнологий, связанных с синтезом запасных веществ.
+
У монографії узагальнено результати біотехнологічних, цитологічних, молекулярно-генетичних досліджень в галузі сучасних біотехнологій пшениці, зокрема клітинної селекції та генетичної інженерії, спрямованих на одержання форм, стійких до біотичних та абіотичних стресових чинників довкілля. Представлені дані стосуються досліджень, пов'язаних із введенням рослинних тканин і органів у культуру in vitro, аналізом природної та індукованої генетичної мінливості клітинних популяцій, добором мутантних клітин, регенерацією із них рослин. Розглядаються методи дорощування та тиражування стійких регенерантів, укорінення та адаптації отриманих рослин до умов in vivo. Значна увага приділена методичним прийомам, пов'язаним із перевіркою стабільності успадкування ознак стійкості до окремих та комплексу стресових факторів у одержаних калюсних ліній, регенерантів та рослин насіннєвих поколінь. Розглянуті питання поліпшення пшениці за допомогою генетичної інженерії. Описано різні підходи до генетичної трансформації даної культури та досягнення у впровадженні корисних ознак шляхом генетичної інженерії. Детально висвітлено результати цитологічного та молекулярно-генетичного аналізу калюсних культур та рослин-регенерантів у процесі добору стійких форм.
 +
 
 +
Для спеціалістів в галузі біотехнології, генетики, молекулярної біології, сільського господарства, студентів та викладачів ВУЗів.
 +
 
 +
Відповідальний редактор академік НАН України В.В.&nbsp;Моргун.
 +
 
 +
Рецензенти: член-кореспондент НАН України В.А.&nbsp;Кунах та доктор біологічних наук, професор Т.В.&nbsp;Чугункова.
 +
 
 +
Затверджено до друку вченою радою Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.
 +
 
 +
 
 +
 
 +
 
 +
ПЕРЕДМОВА
 +
 
 +
Пшениця є членом родини ‘’Poaceae’’, яка включає в себе основні зернові культури світу, такі як кукурудза, пшениця і рис. Серед продовольчих культур, пшениця є одним з найбільш поширених джерел енергії і білків для населення земної кулі. Дев’яносто п'ять відсотків пшениці, що вирощують в даний час, відноситься до типу гексаплоїдної, що використовується для виготовлення хліба та інших хлібобулочних виробів. Майже всі інші 5 % є твердою (тетраплоїдною) пшеницею, яка в основному використовується для виготовлення пасти, макаронів і печива.
 +
 
 +
Останніми роками селекціонерами приділялася велика увага генетичному поліпшенню пшениці з метою підвищення врожайності і зведення до мінімуму втрат у зв'язку з несприятливими умовами навколишнього середовища для сільськогосподарських культур і нападу різних шкідників і патогенів. Однак традиційні методи селекції пшениці, засновані на процесах схрещування, беккросування і добору, виявилися досить трудомісткими і, значно відстають від швидкої коеволюції патогенних мікроорганізмів і шкідників. Крім того, пшениця характеризується великим розміром генома (близько 17 мільярдів пар нуклеотидів), що робить процес її поліпшення будь-яким способом генетично складною задачею.
 +
 
 +
В останні роки біотехнологія стає одним з новітніх інструментів сільськогосподарських досліджень. У поєднанні з традиційною практикою селекції рослин, біотехнологія вносить вклад у розвиток нових методів генетичних змін розвитку рослин та їх продуктивності. Біотехнологічні підходи мають потенціал, щоб доповнити традиційні методи селекції за рахунок скорочення часу, необхідного для виробництва сортів з поліпшеними характеристиками. Традиційна селекція використовує доместиковані (районовані) сорти сільськогосподарських культур і пов'язаних з ними види як джерело генів для вдосконалення існуючих сортів, і цей процес передбачає передачу набору генів від донора до реципієнта. На противагу цьому, біотехнологічні підходи дозволяють передавати бажані гени з будь-якого організму, тим самим збільшувати доступний генофонд для поліпшення. Біотехнологія запропонувала можливе рішення, по-перше, за рахунок зниження витрат виробництва, отримуючи рослини, стійкі до різних абіотичних і біотичних стресів, а по-друге, за рахунок підвищення якості продукції (тобто по підвищенню якості кінцевого продукту, поживної цінності, обробки або характеристики зберігання). Розвиток технологій ‘‘in vitro’’ доповнює традиційні методи селекції пшениці у створенні генетичної мінливості, необхідної для отримання нових сортів із заданими ознаками.
 +
 
 +
Розробка ефективних біотехнологій, спрямованих на створення рослин пшениці, стійких до хвороб та стресових чинників довкілля, пов'язана з вирішенням цілої низки фундаментальних питань на яких базується клітинна селекція, сомаклональна мінливість, генетична інженерія. Це, насамперед, дослідження, пов’язані із введенням рослинних тканин і органів в культуру ‘‘in vitro’’, аналізом індукованої і природної генетичної мінливості клітинних популяцій, добором мутантних клітин, регенерацією із них рослин і мікроклональним розмноженням регенерантів. Представлені в даній монографії результати біотехнологічних, цитологічних, молекулярно-генетичних досліджень є важливими у галузі клітинних технологій, спрямованих на одержання стійких форм рослин.
 +
 
 +
У першому розділі монографії коротко представлено біологічну характеристику і господарське значення пшениці та наведено відомості про основні чинники, що обмежують її врожайність. Біотехнологія пшениці має давні традиції, що пов'язано із практичною значимістю цієї важливої сільськогосподарської культури, яка вирощується у багатьох країнах світу. Тому вирішення низки питань генетики і селекції цієї культури біотехнологічними методами є важливим і актуальним питанням сьогодення.
 +
 
 +
Другий розділ монографії присвячено аналізу процесів морфогенезу та методичним питанням розробки системи ‘‘in vitro’’ для отримання рослин-регенерантів пшениці. На початку розділу детально викладено методичні прийоми, пов’язані із введенням пшениці в культуру ‘‘in vitro’’, розпочинаючи із стерилізації різних тканин і органів рослин ярих та озимих сортів м'якої пшениці. Представлено результати досліджень щодо впливу типу та віку експланта на частоту калюсогенезу та регенерації пагонів, особливості утворення морфогенного калюсу та індукування рослин-регенерантів у культурі листкових експлантів, зрілих та незрілих зародків, апікальних меристем та верхівок пагонів. Наведено дані щодо морфогенетичного потенціалу високопродуктивних сортів озимої пшениці в культурі апікальних меристем. Значна увага приділена оптимізації складу живильних середовищ для підвищення частоти калюсогенезу та регенерації пагонів шляхом використання синтетичних ауксинів та цитокінінів. Наприкінці цього розділу монографії представлено інформацію щодо генетичного контролю морфогенезу рослинних клітин в культурі ‘‘in vitro’’.
 +
 
 +
Сучасний стан і новітні біотехнологічні розробки у галузі клітинних технологій дозволяють успішно їх використовувати для одержання нових форм рослин, а також поліпшення важливих сільськогосподарських культур. Третій розділ даної книги присвячено обґрунтуванню та розв'язанню теоретичних і практичних задач, що пов'язані із клітинною селекцією пшениці на стійкість до біотичних та абіотичних стресів, а також генетичну регуляцію стійкості до стресових чинників довкілля. Представлено дані літератури по створенню в умовах ‘‘in vitro’’ форм, стійких до низки хвороб, зокрема фузаріозу колосу, септоріозу листя, кореневих гнилей. Узагальнено також результати досліджень з клітинної селекції пшениці на стійкість до посухи, засолення, екстремальних температур та інших стресових чинників.
 +
 
 +
Наведені у монографії результати роботи по одержанню в культурі ‘‘in vitro’’ форм пшениці, стійких до офіобольозної кореневої гнилі (‘’Gaeumannomyces graminis’’ var. ‘’tritici’’) є цілком оригінальними. Описано систему біотехнологічних прийомів, які дозволили одержати стійкі калюсні лінії та індукувати із них рослини-регенеранти. Представлено методи оцінки стійкості одержаних рослин у насіннєвих поколіннях.
 +
 
 +
У четвертому розділі монографії наведено результати досліджень із селекції пшениці ‘‘in vitro’’ на комплексну стійкість до стресових чинників довкілля. Основна увага приділена розробці технології отримання рослин м’якої пшениці з підвищеною толерантністю до метаболітів збудника офіобольозу та водного дефіциту, а також удосконаленню процесу отримання регенерантів у культурі апікальних меристем пагонів. Значна увага приділена методам комплексної оцінки стійкості рослин-регенерантів та рослин насіннєвих поколінь в умовах лабораторних та вегетаційних дослідів.
 +
 
 +
Перед дослідниками часто постає проблема переведення отриманих у стерильній культурі рослин-регенерантів у природні умови нестерильного ґрунту. Тому достатньо велику увагу приділено методам дорощування та тиражування стійких рослин-регенерантів, укорінення та адаптації отриманих рослин до умов ‘‘in vivo’’. Значна увага приділена методичним прийомам, пов’язаним із перевіркою стабільності успадкування ознак стійкості до окремих та комплексу стресових факторів у одержаних калюсних ліній та рослин-регенерантів. Саме ці питання висвітлено у завершальних частинах даного розділу.
 +
 
 +
П'ятий розділ монографії присвячено дослідженню мінливості геному пшениці при культивуванні ‘‘in vitro’’ та за дії стресових чинників. Детально розглянуто дані літератури щодо мінливості числа і структури хромосом, перебудов нуклеотидних послідовностей ДНК, активації мобільних генетичних елементів та метилування ДНК. Треба відмітити, що особливості геномної мінливості калюсних культур та рослин регенерантів пшениці у процесі отримання форм, стійких до абіотичних та біотичних стресових чинників, на час проведення наших експериментів були практично не вивчені. Нами вперше досліджена геномна мінливість калюсних культур та рослин-регенерантів пшениці в процесі отримання форм, стійких як до одного стресора, так і з комплексною стійкістю. Наводяться результати цитогенетичного та молекулярно-генетичного дослідження калюсів та рослин регенерантів у процесі добору форм, стійких як до токсину збудника офіобольозу, так і з комплексною стійкістю до водного дефіциту. Проаналізовано молекулярно-генетичний поліморфізм клітинних ліній пшениці, стійких до біотичного та абіотичного стресорів, та регенерантів з них. Приділено увагу ідентифікація генів стійкості до водного дефіциту у рослин-регенерантів за допомогою функціональних маркерів. Ці експериментальні дослідження наведено у другій частині даного розділу.
 +
 
 +
В останні десятиліття ми стали свідками широкого використання різноманітних підходів для перенесення екзогенної ДНК в клітини рослин. Генетична інженерія рослин – це технологія створення генетично модифікованих форм шляхом перенесення функціонально активних генетичних структур (рекомбінантних ДНК), сконструйованих ‘‘in vitro’’, в ДНК організму, що модифікується. У шостому розділі даної монографії розглянуто методи доставки рекомбінантної ДНК, способи прямого введення генів у клітину, основні стратегії для введення мультигенів у рослинні клітини, генетична інженерія пластид рослин, створення безмаркерних рослин, а також методи трансформації без використання селективних маркерів. Друга частина даного розділу присвячена розгляду питань поліпшення пшениці за допомогою генетичної інженерії. Описано різні підходи до генетичної трансформації даної культури та досягнення у впровадженні корисних ознак шляхом генетичної інженерії.
 +
 
 +
Найбільш поширеним методом для рослин є генетична трансформація з використанням бактерії ‘‘Agrobacterium’’ як біологічного вектора для передачі екзогенних Т-ДНК в рослинну клітину. Поліпшення технологій ‘‘Agrobacterium’’-oпосередкованої трансформації до середини 1990-х років, призвели до бажаної генетичної модифікації пшениці. У сьомому розділі книги детально описано чинники, які впливають на ефективність Т-ДНК доставки у пшениці: первинні експланти; штами ‘‘Agrobacterium’’, векторні плазміди, склад живильних середовищ; умови трансформації, наявність поверхнево-активних речовин або індукційних агентів при інокуляції та кокультивуванні, селективні та маркерні гени. Наведено власні експериментальні дані щодо ‘‘Agrobacterium’’-опосередкованої трансформації м'якої пшениці з використанням різних типів експлантів.
 +
 
 +
Найбільш активно застосовуваним методом прямого перенесення генів є спосіб генетичної трансформації рослин з використанням установки «short gun» (англ. дробовик), названий біобалістичною трансформацією. В останні роки бомбардування мікрочастинками стало найбільш уживаним методом для впровадження різних маркерних генів у пшеницю та успішно використовується для введення агрономічно важливих генів. У останньому, восьмому розділі монографії коротко наведено літературні дані щодо основних параметрів, недоліки та переваги, проблеми та досягнення даного типу трансформації у пшениці. Представлено власні експериментальні дані щодо генетичної трансформації пшениці з використанням калюсних культур та аналізу геномної мінливості трансформованих клітинних культур.
 +
 
 +
Дана монографія побудована на узагальненні власних та аналізі літературних даних в галузі біотехнології пшениці, зокрема сучасних клітинних технологій, таких як селекція ‘‘in vitro’’ та генетична інженерія, які широко використовуються у селекції та генетиці пшениці. Знайомство з результатами біотехнологічних досліджень, що мають практичне значення, а також фундаментальними теоретичними розробками в галузі клітинної та генної інженерії, цитологічними та молекулярно-генетичними основами створення нових форм пшениці, стійких до екологічних стресів, представленими у монографії, буде корисним для широкого кола науковців, спеціалістів сільського господарства, викладачів та студентів.
 +
 
 +
== ЗМІСТ ==
 +
Перелік умовних скорочень … 3<br>
 +
Передмова … 5<br>
 +
 
 +
Розділ 1. Біологічна характеристика та господарське значення пшениці і чинники, що обмежують її урожайність … 11<br>
 +
 
 +
Розділ 2. Морфогенез пшениці в культурі ‘‘in vitro’’ … 16<br>
 +
2.1. Введення пшениці в культуру ‘‘in vitro’’ … 17<br>
 +
2.2. Впливу типу та віку експланта на частоту калюсогенезу та регенерації пагонів … 20<br>
 +
2.2.1.Частота утворення морфогенного калюсу та регенерація пагонів у культурі листкових експлантів&nbsp;...&nbsp;22<br>
 +
2.2.2. Частота утворення морфогенного калюсу та регенерація пагонів у культурі незрілих зародків … 24<br>
 +
2.2.2.1. Вплив низькотемпературної обробки зернівок на частоту утворення морфогенного калюсу з незрілих зародків … 27<br>
 +
2.2.3. Дослідження процесів морфогенезу в культурі зрілих зародків … 28<br>
 +
2.2.4. Частота утворення морфогенного калюсу та регенерація в культурі верхівки пагона … 30<br>
 +
2.2.5. Дослідження процесів морфогенезу в культурі апікальної меристеми пагона проростків … 32<br>
 +
2.2.6. Морфогенез у культурі апікальних меристем пагонів високопродуктивних сортів озимої пшениці … 35<br>
 +
2.3. Використання біологічно активних речовин для підвищення частоти морфогенезу … 40<br>
 +
2.3.1. Вплив синтетичних ауксинів на процеси калюсогенезу та регенерації пагонів … 40<br>
 +
2.3.2. Вплив тідіазурону на процеси морфогенезу в культурі ‘‘in vitro’’ пшениці … 43<br>
 +
2.3.3. Ефективність використання антибіотика цефотаксиму для стимулювання морфогенетичних процесів … 48<br>
 +
2.3.4. Вплив хітозану на процеси морфогенезу пшениці в культурі ‘‘in vitro’’ … 54<br>
 +
2.3.5. Вплив саліцилової кислоти на процеси морфогенезу в культурі верхівки пагона … 58<br>
 +
2.4. Оптимізація складу живильних середовищ для підвищення частоти калюсогенезу та регенерації пагонів … 60<br>
 +
2.5. Генетичний контроль морфогенезу клітин рослин в культурі ‘‘in vitro’’ … 63<br>
 +
 
 +
Розділ 3. Клітинна селекція пшениці на стійкість до стресових чинників довкілля … 81<br>
 +
3.1. Клітинна селекція пшениці на стійкість до біотичних стресів … 83<br>
 +
3.2. Клітинна селекція пшениці на стійкість до абіотичних стресів … 91<br>
 +
3.3. Генетична регуляція стійкості до абіотичних стресових чинників … 96<br>
 +
3.4. Селекція ‘‘in vitro’’ пшениці на стійкість до Gaeumannomyces graminis var. tritici … 100<br>
 +
3.4.1. Отримання та визначення токсичності культурального фільтрату гриба G. graminis var. tritici … 100<br>
 +
3.4.2. Добір стійких до культурального фільтрату гриба G. graminis var. tritici калюсних культур пшениці … 101<br>
 +
3.4.3. Фрагментація ДНК калюсних ліній за клітинної селекції … 105<br>
 +
3.4.4. Підвищення регенераційної здатності калюсних культур м’якої пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici … 106<br>
 +
3.4.5. Укорінення рослин-регенерантів, індукованих із стійких калюсних ліній, та переведення їх в ґрунт … 108<br>
 +
3.4.6. Оцінка стійкості рослин до збудника офіобольозної кореневої гнилі … 110<br>
 +
3.4.6.1. Оцінка стійкості рослин до КФ G. graminis var. tritici … 111<br>
 +
3.4.6.2. Оцінка стійкості рослин R1 та R2 методом агарових дисків … 114<br>
 +
3.4.6.3. Оцінка стійкості рослин R1 до G. graminis var. tritici в умовах вегетаційного досліду … 115<br>
 +
 
 +
Розділ 4. Селекція ‘‘in vitro’’ м’якої пшениці на комплексну стійкість до стресових чинників … 118<br>
 +
4.1. Перевірка стійкості калюсних культур до метаболітів збудника офіобольозу … 120<br>
 +
4.2. Порівняння ефективності селективних систем з поліетиленгліколем та манітом для добору стійких до водного дефіциту форм пшениці … 121<br>
 +
4.3. Добір стійких до водного дефіциту калюсних культур пшениці … 127<br>
 +
4.4. Дисперсійний аналіз оцінки сили впливу різних факторів на частоту виживання калюсних культур пшениці за різних типів селекції … 132<br>
 +
4.5. Підвищення регенераційної здатності стійких калюсних ліній … 135<br>
 +
4.6. Укорінення рослин-регенерантів, індукованих із стійких калюсних ліній, та переведення їх в ґрунт … 137<br>
 +
4.7. Аналіз рівня стійкості клітинних ліній та регенерантів в умовах ‘‘in vitro’’ … 139<br>
 +
4.8. Вміст вільного проліну у рослин-регенерантів … 142<br>
 +
4.9. Оцінка стійкості рослин до стресових факторів в умовах ‘‘in vivo’’ … 143<br>
 +
4.10. Аналіз ознаки стійкості до стресових чинників у рослин R1 … 145<br>
 +
 
 +
Розділ 5. Мінливість геному пшениці в культурі ‘‘in vitro’’ … 150<br>
 +
5.1. Мінливість числа і структури хромосом … 151<br>
 +
5.2. Перебудови нуклеотидних послідовностей ДНК … 155<br>
 +
5.3. Активація мобільних генетичних елементів … 158<br>
 +
5.4. Метилування ДНК … 160<br>
 +
5.5. Мінливість геному м’якої пшениці за дії стресових чинників … 162<br>
 +
5.5.1. Цитогенетична мінливість калюсних культур за дії метаболітів збудника офіобольозу … 163<br>
 +
5.5.2. Аналіз клітинних ліній методом проточної цитометрії … 170<br>
 +
5.5.3. Аналіз рівня плоїдності рослин-регенерантів … 172<br>
 +
5.5.4. Цитогенетичний ефект дії маніту на клітини калюсів м’якої пшениці … 173<br>
 +
5.5.5. Аналіз рівня плоїдності рослин-регенерантів, отриманих із стійких клітинних ліній … 181<br>
 +
5.5.6. Молекулярно-генетичний поліморфізм ДНК клітинних ліній пшениці, стійких до КФ Gaeumannomyces graminis var. tritici, та регенерантів з них … 183<br>
 +
5.5.6.1. Добір праймерів для детекції поліморфізму міжмікросателітних локусів … 184<br>
 +
5.5.7. Виявлення специфічних змін у нуклеотидних послідовностях ДНК клітинних ліній пшениці, стійких до культурального фільтрату G. graminis var. tritici … 186<br>
 +
5.5.8. Виявлення специфічних змін у рослин-регенерантів … 194<br>
 +
5.5.9. Молекулярно-генетичний аналіз калюсних ліній м’якої пшениці та індукованих з них рослин-регенерантів за дії осмотичного стресу … 196<br>
 +
5.5.10. Ідентифікація Dreb1 генів у рослин пшениці … 204<br>
  
Для генетиков, биотехнологов, молекулярных биологов, физиологов растений, студентов, преподавателей ВУЗов.
+
Розділ 6. Генетична трансформація рослин … 213<br>
 +
6.1. Сучасний стан генетичної інженерії рослин … 213<br>
 +
6.2. Генетична трансформація пшениці … 244<br>
 +
6.3. Впровадження корисних ознак шляхом генетичної трансформації … 252<br>
  
В монографії розглянуто сучасний стан молекулярних біотехнологій, спрямованих на підвищення рівня стійкості культурних злаків до осмотичних стресів. Проаналізована перспективність використання генів транскрипційних факторів та структурних генів, пов’язаних із стрес-стійкістю. Значна увага приділена теоретичним і практичним питанням генетичної трансформації рослин ''in vitro'' і ''in planta''. Обговорені епігенетичні питання трансгенеза, в тому числі ті, що стосуються розробки нових siPHK-технологій. Надані результати фізіолого-біохімічних аспектів молекулярних біотехнологій, пов’язаних із синтезом запасних речовин.
+
Розділ 7. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація пшениці … 260<br>
 +
7.1. Умови трансформації … 285<br>
 +
7.2. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація м’якої пшениці з використанням калюсних культур … 291<br>
 +
7.3. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація м’якої пшениці шляхом інокуляції базальної частини пагона … 295<br>
 +
7.4. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація м’якої пшениці шляхом інокуляції апікальної меристеми зародка насіння … 300<br>
  
Рецензенты: Доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент НАН Украины В.А.&nbsp;Кунах и доктор биологических наук, профессор Т.В.&nbsp;Чугункова.
+
Розділ 8. Біобалістична трансформація пшениці … 303<br>
 +
8.1. Генетична трансформація пшениці з використанням калюсних культур, отриманих з апікальної меристеми пагона … 307<br>
 +
8.2. Аналіз трансформованих калюсних культур методом IRAP-ПЛР … 311<br>
  
Утверждено к печати ученым советом Института физиологии растений и генетики НАН Украины.
+
Conclusion … 318<br>
 +
Список посилань … 320
  
 
==Див. також==
 
==Див. також==

Версія за 11:40, 10 серпня 2021

Дубровна О.В., Моргун Б.В., Бавол А.В. Біотехнології пшениці: клітинна селекція та генетична інженерія. К.: Логос, 2014. – 375 с. ISBN 978-966-171-883-7.

УДК 602.6:582.542.11; ББК 28.04+28.592.71; Д79

Дубровна О.В., Моргун Б.В., Бавол А.В. Біотехнології пшениці: клітинна селекція та генетична інженерія

У монографії узагальнено результати біотехнологічних, цитологічних, молекулярно-генетичних досліджень в галузі сучасних біотехнологій пшениці, зокрема клітинної селекції та генетичної інженерії, спрямованих на одержання форм, стійких до біотичних та абіотичних стресових чинників довкілля. Представлені дані стосуються досліджень, пов'язаних із введенням рослинних тканин і органів у культуру in vitro, аналізом природної та індукованої генетичної мінливості клітинних популяцій, добором мутантних клітин, регенерацією із них рослин. Розглядаються методи дорощування та тиражування стійких регенерантів, укорінення та адаптації отриманих рослин до умов in vivo. Значна увага приділена методичним прийомам, пов'язаним із перевіркою стабільності успадкування ознак стійкості до окремих та комплексу стресових факторів у одержаних калюсних ліній, регенерантів та рослин насіннєвих поколінь. Розглянуті питання поліпшення пшениці за допомогою генетичної інженерії. Описано різні підходи до генетичної трансформації даної культури та досягнення у впровадженні корисних ознак шляхом генетичної інженерії. Детально висвітлено результати цитологічного та молекулярно-генетичного аналізу калюсних культур та рослин-регенерантів у процесі добору стійких форм.

Для спеціалістів в галузі біотехнології, генетики, молекулярної біології, сільського господарства, студентів та викладачів ВУЗів.

Відповідальний редактор академік НАН України В.В. Моргун.

Рецензенти: член-кореспондент НАН України В.А. Кунах та доктор біологічних наук, професор Т.В. Чугункова.

Затверджено до друку вченою радою Інституту фізіології рослин і генетики НАН України.



ПЕРЕДМОВА

Пшениця є членом родини ‘’Poaceae’’, яка включає в себе основні зернові культури світу, такі як кукурудза, пшениця і рис. Серед продовольчих культур, пшениця є одним з найбільш поширених джерел енергії і білків для населення земної кулі. Дев’яносто п'ять відсотків пшениці, що вирощують в даний час, відноситься до типу гексаплоїдної, що використовується для виготовлення хліба та інших хлібобулочних виробів. Майже всі інші 5 % є твердою (тетраплоїдною) пшеницею, яка в основному використовується для виготовлення пасти, макаронів і печива.

Останніми роками селекціонерами приділялася велика увага генетичному поліпшенню пшениці з метою підвищення врожайності і зведення до мінімуму втрат у зв'язку з несприятливими умовами навколишнього середовища для сільськогосподарських культур і нападу різних шкідників і патогенів. Однак традиційні методи селекції пшениці, засновані на процесах схрещування, беккросування і добору, виявилися досить трудомісткими і, значно відстають від швидкої коеволюції патогенних мікроорганізмів і шкідників. Крім того, пшениця характеризується великим розміром генома (близько 17 мільярдів пар нуклеотидів), що робить процес її поліпшення будь-яким способом генетично складною задачею.

В останні роки біотехнологія стає одним з новітніх інструментів сільськогосподарських досліджень. У поєднанні з традиційною практикою селекції рослин, біотехнологія вносить вклад у розвиток нових методів генетичних змін розвитку рослин та їх продуктивності. Біотехнологічні підходи мають потенціал, щоб доповнити традиційні методи селекції за рахунок скорочення часу, необхідного для виробництва сортів з поліпшеними характеристиками. Традиційна селекція використовує доместиковані (районовані) сорти сільськогосподарських культур і пов'язаних з ними види як джерело генів для вдосконалення існуючих сортів, і цей процес передбачає передачу набору генів від донора до реципієнта. На противагу цьому, біотехнологічні підходи дозволяють передавати бажані гени з будь-якого організму, тим самим збільшувати доступний генофонд для поліпшення. Біотехнологія запропонувала можливе рішення, по-перше, за рахунок зниження витрат виробництва, отримуючи рослини, стійкі до різних абіотичних і біотичних стресів, а по-друге, за рахунок підвищення якості продукції (тобто по підвищенню якості кінцевого продукту, поживної цінності, обробки або характеристики зберігання). Розвиток технологій ‘‘in vitro’’ доповнює традиційні методи селекції пшениці у створенні генетичної мінливості, необхідної для отримання нових сортів із заданими ознаками.

Розробка ефективних біотехнологій, спрямованих на створення рослин пшениці, стійких до хвороб та стресових чинників довкілля, пов'язана з вирішенням цілої низки фундаментальних питань на яких базується клітинна селекція, сомаклональна мінливість, генетична інженерія. Це, насамперед, дослідження, пов’язані із введенням рослинних тканин і органів в культуру ‘‘in vitro’’, аналізом індукованої і природної генетичної мінливості клітинних популяцій, добором мутантних клітин, регенерацією із них рослин і мікроклональним розмноженням регенерантів. Представлені в даній монографії результати біотехнологічних, цитологічних, молекулярно-генетичних досліджень є важливими у галузі клітинних технологій, спрямованих на одержання стійких форм рослин.

У першому розділі монографії коротко представлено біологічну характеристику і господарське значення пшениці та наведено відомості про основні чинники, що обмежують її врожайність. Біотехнологія пшениці має давні традиції, що пов'язано із практичною значимістю цієї важливої сільськогосподарської культури, яка вирощується у багатьох країнах світу. Тому вирішення низки питань генетики і селекції цієї культури біотехнологічними методами є важливим і актуальним питанням сьогодення.

Другий розділ монографії присвячено аналізу процесів морфогенезу та методичним питанням розробки системи ‘‘in vitro’’ для отримання рослин-регенерантів пшениці. На початку розділу детально викладено методичні прийоми, пов’язані із введенням пшениці в культуру ‘‘in vitro’’, розпочинаючи із стерилізації різних тканин і органів рослин ярих та озимих сортів м'якої пшениці. Представлено результати досліджень щодо впливу типу та віку експланта на частоту калюсогенезу та регенерації пагонів, особливості утворення морфогенного калюсу та індукування рослин-регенерантів у культурі листкових експлантів, зрілих та незрілих зародків, апікальних меристем та верхівок пагонів. Наведено дані щодо морфогенетичного потенціалу високопродуктивних сортів озимої пшениці в культурі апікальних меристем. Значна увага приділена оптимізації складу живильних середовищ для підвищення частоти калюсогенезу та регенерації пагонів шляхом використання синтетичних ауксинів та цитокінінів. Наприкінці цього розділу монографії представлено інформацію щодо генетичного контролю морфогенезу рослинних клітин в культурі ‘‘in vitro’’.

Сучасний стан і новітні біотехнологічні розробки у галузі клітинних технологій дозволяють успішно їх використовувати для одержання нових форм рослин, а також поліпшення важливих сільськогосподарських культур. Третій розділ даної книги присвячено обґрунтуванню та розв'язанню теоретичних і практичних задач, що пов'язані із клітинною селекцією пшениці на стійкість до біотичних та абіотичних стресів, а також генетичну регуляцію стійкості до стресових чинників довкілля. Представлено дані літератури по створенню в умовах ‘‘in vitro’’ форм, стійких до низки хвороб, зокрема фузаріозу колосу, септоріозу листя, кореневих гнилей. Узагальнено також результати досліджень з клітинної селекції пшениці на стійкість до посухи, засолення, екстремальних температур та інших стресових чинників.

Наведені у монографії результати роботи по одержанню в культурі ‘‘in vitro’’ форм пшениці, стійких до офіобольозної кореневої гнилі (‘’Gaeumannomyces graminis’’ var. ‘’tritici’’) є цілком оригінальними. Описано систему біотехнологічних прийомів, які дозволили одержати стійкі калюсні лінії та індукувати із них рослини-регенеранти. Представлено методи оцінки стійкості одержаних рослин у насіннєвих поколіннях.

У четвертому розділі монографії наведено результати досліджень із селекції пшениці ‘‘in vitro’’ на комплексну стійкість до стресових чинників довкілля. Основна увага приділена розробці технології отримання рослин м’якої пшениці з підвищеною толерантністю до метаболітів збудника офіобольозу та водного дефіциту, а також удосконаленню процесу отримання регенерантів у культурі апікальних меристем пагонів. Значна увага приділена методам комплексної оцінки стійкості рослин-регенерантів та рослин насіннєвих поколінь в умовах лабораторних та вегетаційних дослідів.

Перед дослідниками часто постає проблема переведення отриманих у стерильній культурі рослин-регенерантів у природні умови нестерильного ґрунту. Тому достатньо велику увагу приділено методам дорощування та тиражування стійких рослин-регенерантів, укорінення та адаптації отриманих рослин до умов ‘‘in vivo’’. Значна увага приділена методичним прийомам, пов’язаним із перевіркою стабільності успадкування ознак стійкості до окремих та комплексу стресових факторів у одержаних калюсних ліній та рослин-регенерантів. Саме ці питання висвітлено у завершальних частинах даного розділу.

П'ятий розділ монографії присвячено дослідженню мінливості геному пшениці при культивуванні ‘‘in vitro’’ та за дії стресових чинників. Детально розглянуто дані літератури щодо мінливості числа і структури хромосом, перебудов нуклеотидних послідовностей ДНК, активації мобільних генетичних елементів та метилування ДНК. Треба відмітити, що особливості геномної мінливості калюсних культур та рослин регенерантів пшениці у процесі отримання форм, стійких до абіотичних та біотичних стресових чинників, на час проведення наших експериментів були практично не вивчені. Нами вперше досліджена геномна мінливість калюсних культур та рослин-регенерантів пшениці в процесі отримання форм, стійких як до одного стресора, так і з комплексною стійкістю. Наводяться результати цитогенетичного та молекулярно-генетичного дослідження калюсів та рослин регенерантів у процесі добору форм, стійких як до токсину збудника офіобольозу, так і з комплексною стійкістю до водного дефіциту. Проаналізовано молекулярно-генетичний поліморфізм клітинних ліній пшениці, стійких до біотичного та абіотичного стресорів, та регенерантів з них. Приділено увагу ідентифікація генів стійкості до водного дефіциту у рослин-регенерантів за допомогою функціональних маркерів. Ці експериментальні дослідження наведено у другій частині даного розділу.

В останні десятиліття ми стали свідками широкого використання різноманітних підходів для перенесення екзогенної ДНК в клітини рослин. Генетична інженерія рослин – це технологія створення генетично модифікованих форм шляхом перенесення функціонально активних генетичних структур (рекомбінантних ДНК), сконструйованих ‘‘in vitro’’, в ДНК організму, що модифікується. У шостому розділі даної монографії розглянуто методи доставки рекомбінантної ДНК, способи прямого введення генів у клітину, основні стратегії для введення мультигенів у рослинні клітини, генетична інженерія пластид рослин, створення безмаркерних рослин, а також методи трансформації без використання селективних маркерів. Друга частина даного розділу присвячена розгляду питань поліпшення пшениці за допомогою генетичної інженерії. Описано різні підходи до генетичної трансформації даної культури та досягнення у впровадженні корисних ознак шляхом генетичної інженерії.

Найбільш поширеним методом для рослин є генетична трансформація з використанням бактерії ‘‘Agrobacterium’’ як біологічного вектора для передачі екзогенних Т-ДНК в рослинну клітину. Поліпшення технологій ‘‘Agrobacterium’’-oпосередкованої трансформації до середини 1990-х років, призвели до бажаної генетичної модифікації пшениці. У сьомому розділі книги детально описано чинники, які впливають на ефективність Т-ДНК доставки у пшениці: первинні експланти; штами ‘‘Agrobacterium’’, векторні плазміди, склад живильних середовищ; умови трансформації, наявність поверхнево-активних речовин або індукційних агентів при інокуляції та кокультивуванні, селективні та маркерні гени. Наведено власні експериментальні дані щодо ‘‘Agrobacterium’’-опосередкованої трансформації м'якої пшениці з використанням різних типів експлантів.

Найбільш активно застосовуваним методом прямого перенесення генів є спосіб генетичної трансформації рослин з використанням установки «short gun» (англ. дробовик), названий біобалістичною трансформацією. В останні роки бомбардування мікрочастинками стало найбільш уживаним методом для впровадження різних маркерних генів у пшеницю та успішно використовується для введення агрономічно важливих генів. У останньому, восьмому розділі монографії коротко наведено літературні дані щодо основних параметрів, недоліки та переваги, проблеми та досягнення даного типу трансформації у пшениці. Представлено власні експериментальні дані щодо генетичної трансформації пшениці з використанням калюсних культур та аналізу геномної мінливості трансформованих клітинних культур.

Дана монографія побудована на узагальненні власних та аналізі літературних даних в галузі біотехнології пшениці, зокрема сучасних клітинних технологій, таких як селекція ‘‘in vitro’’ та генетична інженерія, які широко використовуються у селекції та генетиці пшениці. Знайомство з результатами біотехнологічних досліджень, що мають практичне значення, а також фундаментальними теоретичними розробками в галузі клітинної та генної інженерії, цитологічними та молекулярно-генетичними основами створення нових форм пшениці, стійких до екологічних стресів, представленими у монографії, буде корисним для широкого кола науковців, спеціалістів сільського господарства, викладачів та студентів.

ЗМІСТ

Перелік умовних скорочень … 3
Передмова … 5

Розділ 1. Біологічна характеристика та господарське значення пшениці і чинники, що обмежують її урожайність … 11

Розділ 2. Морфогенез пшениці в культурі ‘‘in vitro’’ … 16
2.1. Введення пшениці в культуру ‘‘in vitro’’ … 17
2.2. Впливу типу та віку експланта на частоту калюсогенезу та регенерації пагонів … 20
2.2.1.Частота утворення морфогенного калюсу та регенерація пагонів у культурі листкових експлантів ... 22
2.2.2. Частота утворення морфогенного калюсу та регенерація пагонів у культурі незрілих зародків … 24
2.2.2.1. Вплив низькотемпературної обробки зернівок на частоту утворення морфогенного калюсу з незрілих зародків … 27
2.2.3. Дослідження процесів морфогенезу в культурі зрілих зародків … 28
2.2.4. Частота утворення морфогенного калюсу та регенерація в культурі верхівки пагона … 30
2.2.5. Дослідження процесів морфогенезу в культурі апікальної меристеми пагона проростків … 32
2.2.6. Морфогенез у культурі апікальних меристем пагонів високопродуктивних сортів озимої пшениці … 35
2.3. Використання біологічно активних речовин для підвищення частоти морфогенезу … 40
2.3.1. Вплив синтетичних ауксинів на процеси калюсогенезу та регенерації пагонів … 40
2.3.2. Вплив тідіазурону на процеси морфогенезу в культурі ‘‘in vitro’’ пшениці … 43
2.3.3. Ефективність використання антибіотика цефотаксиму для стимулювання морфогенетичних процесів … 48
2.3.4. Вплив хітозану на процеси морфогенезу пшениці в культурі ‘‘in vitro’’ … 54
2.3.5. Вплив саліцилової кислоти на процеси морфогенезу в культурі верхівки пагона … 58
2.4. Оптимізація складу живильних середовищ для підвищення частоти калюсогенезу та регенерації пагонів … 60
2.5. Генетичний контроль морфогенезу клітин рослин в культурі ‘‘in vitro’’ … 63

Розділ 3. Клітинна селекція пшениці на стійкість до стресових чинників довкілля … 81
3.1. Клітинна селекція пшениці на стійкість до біотичних стресів … 83
3.2. Клітинна селекція пшениці на стійкість до абіотичних стресів … 91
3.3. Генетична регуляція стійкості до абіотичних стресових чинників … 96
3.4. Селекція ‘‘in vitro’’ пшениці на стійкість до Gaeumannomyces graminis var. tritici … 100
3.4.1. Отримання та визначення токсичності культурального фільтрату гриба G. graminis var. tritici … 100
3.4.2. Добір стійких до культурального фільтрату гриба G. graminis var. tritici калюсних культур пшениці … 101
3.4.3. Фрагментація ДНК калюсних ліній за клітинної селекції … 105
3.4.4. Підвищення регенераційної здатності калюсних культур м’якої пшениці, стійких до культурального фільтрату Gaeumannomyces graminis var. tritici … 106
3.4.5. Укорінення рослин-регенерантів, індукованих із стійких калюсних ліній, та переведення їх в ґрунт … 108
3.4.6. Оцінка стійкості рослин до збудника офіобольозної кореневої гнилі … 110
3.4.6.1. Оцінка стійкості рослин до КФ G. graminis var. tritici … 111
3.4.6.2. Оцінка стійкості рослин R1 та R2 методом агарових дисків … 114
3.4.6.3. Оцінка стійкості рослин R1 до G. graminis var. tritici в умовах вегетаційного досліду … 115

Розділ 4. Селекція ‘‘in vitro’’ м’якої пшениці на комплексну стійкість до стресових чинників … 118
4.1. Перевірка стійкості калюсних культур до метаболітів збудника офіобольозу … 120
4.2. Порівняння ефективності селективних систем з поліетиленгліколем та манітом для добору стійких до водного дефіциту форм пшениці … 121
4.3. Добір стійких до водного дефіциту калюсних культур пшениці … 127
4.4. Дисперсійний аналіз оцінки сили впливу різних факторів на частоту виживання калюсних культур пшениці за різних типів селекції … 132
4.5. Підвищення регенераційної здатності стійких калюсних ліній … 135
4.6. Укорінення рослин-регенерантів, індукованих із стійких калюсних ліній, та переведення їх в ґрунт … 137
4.7. Аналіз рівня стійкості клітинних ліній та регенерантів в умовах ‘‘in vitro’’ … 139
4.8. Вміст вільного проліну у рослин-регенерантів … 142
4.9. Оцінка стійкості рослин до стресових факторів в умовах ‘‘in vivo’’ … 143
4.10. Аналіз ознаки стійкості до стресових чинників у рослин R1 … 145

Розділ 5. Мінливість геному пшениці в культурі ‘‘in vitro’’ … 150
5.1. Мінливість числа і структури хромосом … 151
5.2. Перебудови нуклеотидних послідовностей ДНК … 155
5.3. Активація мобільних генетичних елементів … 158
5.4. Метилування ДНК … 160
5.5. Мінливість геному м’якої пшениці за дії стресових чинників … 162
5.5.1. Цитогенетична мінливість калюсних культур за дії метаболітів збудника офіобольозу … 163
5.5.2. Аналіз клітинних ліній методом проточної цитометрії … 170
5.5.3. Аналіз рівня плоїдності рослин-регенерантів … 172
5.5.4. Цитогенетичний ефект дії маніту на клітини калюсів м’якої пшениці … 173
5.5.5. Аналіз рівня плоїдності рослин-регенерантів, отриманих із стійких клітинних ліній … 181
5.5.6. Молекулярно-генетичний поліморфізм ДНК клітинних ліній пшениці, стійких до КФ Gaeumannomyces graminis var. tritici, та регенерантів з них … 183
5.5.6.1. Добір праймерів для детекції поліморфізму міжмікросателітних локусів … 184
5.5.7. Виявлення специфічних змін у нуклеотидних послідовностях ДНК клітинних ліній пшениці, стійких до культурального фільтрату G. graminis var. tritici … 186
5.5.8. Виявлення специфічних змін у рослин-регенерантів … 194
5.5.9. Молекулярно-генетичний аналіз калюсних ліній м’якої пшениці та індукованих з них рослин-регенерантів за дії осмотичного стресу … 196
5.5.10. Ідентифікація Dreb1 генів у рослин пшениці … 204

Розділ 6. Генетична трансформація рослин … 213
6.1. Сучасний стан генетичної інженерії рослин … 213
6.2. Генетична трансформація пшениці … 244
6.3. Впровадження корисних ознак шляхом генетичної трансформації … 252

Розділ 7. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація пшениці … 260
7.1. Умови трансформації … 285
7.2. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація м’якої пшениці з використанням калюсних культур … 291
7.3. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація м’якої пшениці шляхом інокуляції базальної частини пагона … 295
7.4. ‘‘Agrobacterium’’-опосередкована трансформація м’якої пшениці шляхом інокуляції апікальної меристеми зародка насіння … 300

Розділ 8. Біобалістична трансформація пшениці … 303
8.1. Генетична трансформація пшениці з використанням калюсних культур, отриманих з апікальної меристеми пагона … 307
8.2. Аналіз трансформованих калюсних культур методом IRAP-ПЛР … 311

Conclusion … 318
Список посилань … 320

Див. також

Категорія:Моргун Б.В.

Особисті інструменти
Простори назв

Варіанти
Дії
 
   
Інструменти